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本制品是一种能在15分钟内高效去除蛋白溶液样品中超过99%的内毒素的试剂盒。初始内毒素浓度为100EU/mL的蛋白样品，经本试剂盒处理后，内毒素含量可以低于0.1EU/mL，达到被认为是无内毒素污染的水平。因此本试剂盒在涉及细胞或动物等实验的样品去内毒素处理时有广泛应用。本试剂盒专门对于蛋白样品的内毒素去除进行了优化，也可用于核酸或小分子溶液样品的内毒素去除，但核酸样品的内毒素去除效果比蛋白的要略差一些。

• 内毒素清除效率高、操作简单快捷：用户仅需将本试剂盒提供的Endotoxin Removal Solution按照一定比例加入到待处理的蛋白样品中，并通过特定温度孵育和离心操作，最快10～15分钟左右即可完成一轮内毒素清除处理；Endotoxin Removal Solution为即用型试剂，无需配制、稀释等步骤，可直接使用；在实测的内毒素含量为100EU～10MEU范围内，内毒素清除率均>99%，可有效将样品内毒素含量降低1000～2000倍；经过1～3轮内毒素清除处理后，可实现将样品内毒素含量降低1000～20000倍。
  
• 不影响蛋白质生物学活性，且样品损失量极低：本试剂盒提供的Endotoxin Removal Solution可高效清除蛋白样品中的内毒素，并极大地保留了蛋白质的生物学活性；且蛋白样品损耗量非常小，通常每次处理仅损失约1～5%的蛋白量；处理完毕后，蛋白样品中Endotoxin Removal Solution残留量极低，对大多数生物学实验无明显影响。
  
• 可处理样品体积范围宽：本试剂盒适用于几十微升 到几十毫升的蛋白样品内毒素清除处理。
  
• 试剂盒组分齐全：本试剂盒提供内毒素清除试剂Endotoxin Removal Solution A和B，水相和有机相分层颜色指示剂Separation Indicator，用户可根据实验要求自行选择使用。

两种规格的本试剂盒分别可以清除约100mL和500mL蛋白样品中的内毒素，按照每次处理500μL样品，两种规格分别可处理200个和1000个蛋白样品。

• 本试剂盒不适用于处理含有高浓度甘油(≥10%)的蛋白样品。甘油会影响内毒素清除过程中水相与有机相分层的效果。
  
• 待处理的蛋白样品的浓度，通常不宜超过30mg/mL，具体可适用的最高蛋白浓度因蛋白性质不同而略有差异。浓度过高时，可以尝试将蛋白样品适当稀释后再使用本试剂盒进行内毒素清除处理。
  
• 实验所用的器皿须为无内毒素的。如果是常规的玻璃器皿，须经预处理以去除可能存在的外源性内毒素，常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可以采用其他确保不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。如果使用塑料器皿，应选用注明无内毒素并且对实验无干扰的器械。
  
• 实验所用试剂及溶液均需为无内毒素，以免造成外源内毒素的污染。
  
• 实验操作过程应防止微生物的污染。

• 蛋白样品清除内毒素处理：
  以下操作过程以处理500μL蛋白样品为例，也可按照实际待处理样品体积等比例缩小或扩大各试剂的用量。冻存的试剂解冻后需充分溶解并混匀后使用。
  
  • 取500μL待处理的蛋白样品于1.5mL的无内毒素离心管中。
    
  • 加入100μL Endotoxin Removal Solution A，涡旋振荡混匀，此时溶液变浑浊。
    
  • 加入120μL Endotoxin Removal Solution B，混匀，此时溶液仍浑浊。
    
  • 可选步骤：加入1μL Separation Indicator，混匀。
    
    • Separation Indicator为水相和有机相分层的颜色指示剂。若向样品中加入此试剂，在后续高速离心实现两相分离后，下层内毒素所在的有机相会呈现浅红色，而上层蛋白水相的颜色不受影响，这样水相和有机相呈现明显的颜色差异，以方便准确分辩两相。
  • 4℃或冰上孵育5分钟，此时溶液变透明。
    
  • 37℃孵育1分钟，此时溶液呈现明显乳白色浑浊状态。
    
  • 25℃或室温，12000～14000g，离心5分钟，以形成两相分离，经内毒素清除处理后的蛋白位于上层水相，内毒素以有机相位于离心管底部。
    
    • 此步骤不能进行低温或4℃离心，否则会显著影响内毒素的清除效果。
    • 此步骤离心后，必须呈现明显的两相分层，才能达到高效去除内毒素的目的。若无明显分层，需考虑操作过程中的温度、时间、离心力的控制是否严谨，如有偏差，请严格按照使用说明重复步骤e-g并观察分层效果；样品浓度、pH值、初始内毒素浓度也会在一定程度上影响分层效果，建议也可重复步骤b-g，重新进行一轮内毒素清除处理并观察分层效果。
    • 如果待处理样品蛋白浓度过高(＞30mg/mL)，离心后可能会出现许多油性液滴悬浮于溶液中，无法形成下层有机相分离的效果，建议使用无内毒素的蛋白储存液对样品适当稀释后再进行内毒素清除处理。
    • 如果在步骤d向样品中加入了1μL的水相和有机相分层颜色指示剂Separation Indicator，则下层有机相会呈现浅红色，上层水相颜色没有变化。
  • 尽快小心吸出上层水相至新的无内毒素1.5mL离心管中，弃除有机相，以免长时间放置后水相与有机相进一步交融，影响内毒素清除效果。
    
  • 推荐使用细菌内毒素检测试剂盒对进行内毒素清除处理后的样品进行内毒素含量的检测。
    
  • 可选步骤：步骤b～h的每重复操作一次，可以更有效地去除内毒素，若待处理样品中内毒素含量非常高，可重复步骤b～h 1～2次，以充分清除样品中残留的内毒素。
• 样品中可能残留极少量Endotoxin Removal Solution的处理：
  蛋白样品经内毒素清除处理后，可能会残留极少量的Endotoxin Removal Solution，通常不会影响绝大多数蛋白的生物活性，对后续实验操作也不会产生干扰；如需彻底去除样品中残留的Endotoxin Removal Solution，推荐通过凝胶过滤色谱(Gel filtration chromatography,GFC)或透析的方法充分清除经内毒素清除处理后的蛋白样品中残留的Endotoxin Removal Solution。

• 本试剂盒可高效去除内毒素，能在15分钟内对内毒素浓度为10²～10⁷EU/mL的蛋白样品完成内毒素清除处理，清除率均大于99%。本试剂盒用于清除蛋白溶液中内毒素的实验流程和效果请参考图1。
  
  
  
  图1.本试剂盒用于清除BSA溶液中内毒素的实验流程图和效果图。图A为使用本试剂盒用于清除BSA溶液中内毒素的实验流程图。称取15mg的BSA于1.5mL无内毒素离心管中，使用500μL无内毒素的1×PBS进行溶解，配制成终浓度为30mg/mL的BSA溶液，此时溶液澄清透明，且内毒素含量较高；随后向BSA溶液中依次加入100μL的Endotoxin Removal Solution A、120μL Endotoxin Removal Solution B和1μL的Separation Indicator，涡旋振荡混匀，此时溶液变浑浊；4℃孵育5分钟后溶液变澄清透明；随后37℃孵育1分钟，溶液呈现乳白色浑浊；25℃或室温，12000～14000g，离心5分钟，溶液呈现明显的无色水相与浅红色有机相分层；小心将上层水相转移至新的无内毒素的1.5mL离心管中，即完成对BSA溶液样品的内毒素清除处理。图B为内毒素清除处理前后的BSA溶液中内毒素含量显色反应效果图。使用细菌内毒素检测试剂盒对内毒素清除处理前后的BSA溶液样品进行内毒素显色反应及含量检测，结果显示，内毒素清除处理前的BSA样品内毒素显色反应为紫色，指示其内毒素含量较高，经测定内毒素含量约为100EU/mL；经一次内毒素清除处理的BSA溶液样品内毒素显色反应为无色，指示其内毒素含量极低，经测定内毒素含量约为0.1EU/mL。此结果表明，本试剂盒可有效清除BSA样品中的内毒素。图C为内毒素清除处理前后的BSA溶液中蛋白含量电泳图。取10μL内毒素清除处理前后的BSA样品，加入2μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，拍照观察结果。实验结果显示，使用本试剂盒对BSA样品进行内毒素清除处理前后蛋白含量损失很少。实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
  
• 用于不同内毒素含量的蛋白溶液进行内毒素清除处理的效率请参考图2。
  
  
  
  图2.本试剂盒用于不同内毒素含量的BSA溶液进行内毒素清除处理的效率图。使用本试剂盒对500μL内毒素含量为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷EU/mL的30mg/mL的BSA溶液样品，分别进行1～3次内毒素清除处理。结果显示，第1次内毒素清除处理的效率均≥99%，可有效将样品内毒素含量降低1000～2000倍；经1～3次内毒素清除处理后，可有效将样品内毒素含量降低1000～20000倍。以上实验结果均说明本试剂盒可实现高效清除蛋白样品中内毒素的目的。图中①、②、③分别表示不同初始内毒素浓度的样品分别进行的第一、第二和第三次内毒素清除处理；①、②、③下边的第一行数字为该次内毒素清除操作后样品中残留的内毒素含量，第二行数字为每次内毒素的清除百分率。实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。